蛋白相互作用研究平台@XBio

细胞中的各种生命活动与蛋白质间的相互作用紧密相关,因此深入理解蛋白质相互作用,研究出蛋白质相互作用网络是揭示生命活动奥秘的前提。蛋白质科学技术的不断发展,使得发现新蛋白质以及研究蛋白质间的相互作用,研究其功能和机制成为生命科学领域研究的重点。研究蛋白质相互作用分为两步:鉴定与目的蛋白质有相互作用的候选蛋白质;在蛋白分子水平和细胞水平确定目的蛋白与候选蛋白间的相互作用,及对其功能的影响。

GST pull-down实验
基于谷胱甘肽巯基转移酶(glutathione S-transferase,GST)融合蛋白的GST pull-down实验是一个行之有效的在蛋白分子水平直接验证蛋白蛋白相互作用的体外实验技术。GST pull-down实验基本原理是将靶蛋白-GST融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上,作为与目的蛋白亲和的支撑物,充当一种“诱饵蛋白”;目的蛋白溶液过柱,可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白),洗脱结合物后通过SDS-PAGE电泳分析,从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白。“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。

基于荧光共振能量转移技术(FRET)的蛋白相互作用研究
荧光能量共振转移是距离很近的两个荧光分子间产生的一种能量转移现象。当供体荧光分子的发射光谱与受体荧光分子的吸收光谱重叠,并且两个分子的距离在10nm范围以内时,就会发生一种非放射性的能量转移,即FRET现象,使得供体的荧光强度比它单独存在时要低的多(荧光猝灭),而受体发射的荧光却大大增强(敏化荧光)。在生命科学领域,FRET技术是检测生物大分子纳米级距离和纳米级距离变化的有力工具,可用于检测两个蛋白质分子是否存在直接的相互作用。如果两个蛋白质分子存在FRET现象,证实两个蛋白质分子的距离在10nm之内,证实这两个蛋白质分子存在直接相互作用。

免疫共沉淀技术(Co-Immunoprecipitation, Co-IP)
免疫共沉淀是利用抗原和抗体的特异性结合以及细菌的Protein A或G特异性地结合到免疫球蛋白的Fc片段的现象开发出来的方法。其基本原理是,在细胞裂解液中加入抗兴趣蛋白的抗体,孵育后再加入与抗体特异结合的结合于Agarose珠上的Protein A或G,若细胞中存在与兴趣蛋白相结合的目的蛋白,就可以形成蛋白复合物:“目的蛋白—兴趣蛋白—抗兴趣蛋白抗体—Protein A或G”;经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,复合物被分开,目的蛋白可以通过免疫印迹实验被检测到。这种方法得到的目的蛋白是在细胞内与兴趣蛋白天然结合在一起的,相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的,且是在细胞生理环境状态下进行的,得到的蛋白相互作用结果可信度高。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合;也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。

哺乳细胞双杂交系统(Mammalian two-hybrid,M2H)
哺乳细胞双杂交系统是在细胞水平检测蛋白-蛋白相互作用的极强有力方法。双杂交系统基于转录因子蛋白的两个功能域,结合特异DNA序列的DNA结合域和激活转录功能的转录激活域;当转录激活域和DNA结合域相互靠近一起时,可以启动RNA聚合酶II复合体的装配,启动下游报告基因的转录。通过检测下游报告基因产物的酶活性,可以验证蛋白之间的相互作用。在哺乳动物双杂交系统中,一个质粒表达融合蛋白“X”,与DNA结合域Gal4蛋白融合;另一个质粒表达融合蛋白“Y”,与转录激活域VP16蛋白融合。当融合蛋白“X”与“Y”存在相互作用时,DNA结合域就与转录激活域就相互靠近,启动下游报告基因转录。哺乳细胞双杂交系统可在所选细胞系中研究蛋白相互作用,表达的蛋白质更好地保持了糖基化、磷酸化和酰基化等翻译后的修饰,处于更天然的结构状态;通过瞬时转染目的细胞,可以快速在细胞水平验证蛋白相互作用。